Termékek
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR kimutatási készlet 2019-nCoV-hoz
Várható használat
Ez a készlet az új koronavírus (2019-nCoV) kvalitatív kimutatására szolgál torokváladék, orrgarati váladék, bronchoalveoláris mosófolyadék és köpet felhasználásával. A termék kimutatási eredménye kizárólag klinikai referenciaként szolgál, és nem használható fel a klinikai diagnózis és kezelés egyetlen bizonyítékaként. A beteg állapotának átfogó elemzése ajánlott a klinikai tünetek és egyéb laboratóriumi vizsgálatok együttes figyelembevételével.
Ellenőrzési elv
A készlet egylépéses RT-PCR technológián alapul. Valójában a 2019-es új koronavírus (2019-nCoV) ORF1ab és N génjeit választották amplifikációs célpontként. Specifikus primereket és fluoreszcens próbákat (az N gén próbák FAM-mal, az ORF1ab próbák HEX-szel vannak jelölve) terveztek a 2019-es új típusú koronavírus RNS-ének kimutatására a mintákban. A készlet tartalmaz egy endogén belső kontroll detektáló rendszert is (CY5-tel jelölt belső kontroll gén próba) a mintavétel, az RNS és a PCR amplifikáció folyamatának monitorozására, ezáltal csökkentve a téves negatív eredményeket.
Fő alkatrészek
| Alkatrészek | Kötet()48T/Készlet) |
| RT-PCR reakcióoldat | 96 µl |
| nCOV primer TaqMan próbakeverék (ORF1ab, N gén, RnaseP gén) | 864 µl |
| Negatív kontroll | 1500 µl |
| nCOV pozitív kontroll (l ORF1ab N gén) | 1500 µl |
Saját reagensek: RNS extrakciós vagy tisztító reagensek. Negatív/pozitív kontroll: A pozitív kontroll a célfragmentumot tartalmazó RNS, míg a negatív kontroll nukleinsavmentes víz. Használat során részt kell venniük az extrakcióban, és fertőzőnek kell tekinteni őket. A vonatkozó előírásoknak megfelelően kell kezelni és ártalmatlanítani őket.
A belső referenciagén az emberi RnaseP gén.
Tárolási feltételek és lejárati dátum
-20±5℃, kerülje az ismételt fagyasztást és felolvasztást több mint 5 alkalommal, 6 hónapig érvényes.
Alkalmazható eszköz
FAM / HEX / CY5 és más többcsatornás fluoreszcens PCR készülékkel.
Mintadarab-követelmények
1. Alkalmazható mintatípusok: torokváladék, orrgarati váladék, bronchoalveoláris lavage folyadék, köpet.
2. Mintavétel (aszeptikus technika)
Garatváladék: Két törlővel egyszerre törölje át a mandulákat és a garat hátsó falát, majd merítse a törlőkendő fejét a mintavételi oldatot tartalmazó kémcsőbe.
Köpet: Miután a beteg mélyen köhögött, gyűjtse össze a kiköhögött váladékot egy csavaros kupakú kémcsőbe, amely a mintavételi oldatot tartalmazza; bronchoalveoláris mosófolyadék：Mintavétel egészségügyi szakember által. 3. A minták tárolása és szállítása
A vírusizolálásra és RNS-vizsgálatra szánt mintákat a lehető leghamarabb meg kell vizsgálni. A 24 órán belül kimutatható mintákat 4 °C-on lehet tárolni; azokat, amelyeket 24 órán belül nem lehet kimutatni,
órákban -70 ℃-on vagy az alatt kell tárolni (ha nincsenek -70 ℃-os tárolási feltételek, akkor azokat
(ideiglenesen -20 ℃-on hűtőszekrényben tárolva). A mintákat szállítás közben kerülni kell az ismételt fagyasztást és felengedést. A mintákat a gyűjtés után a lehető leghamarabb a laboratóriumba kell küldeni. Ha a mintákat nagy távolságra kell szállítani, szárazjégben történő tárolás ajánlott.
Vizsgálati módszerek
1 Mintafeldolgozás és RNS-kivonás (mintafeldolgozó terület)
Az RNS-kivonáshoz 200 μl folyékony minta vétele ajánlott. A kapcsolódó extrakciós lépésekkel kapcsolatban lásd a kereskedelmi forgalomban kapható RNS-extrakciós készletek utasításait. Mind a negatív, mind a negatív
A készletben található kontrollok részt vettek az extrakcióban.
2 PCR reagens előkészítése (reagens előkészítő terület)
2.1 Vegye ki az összes komponenst a készletből, majd szobahőmérsékleten olvassza fel és keverje össze. Használat előtt centrifugálja 8000 fordulat/perc sebességgel néhány másodpercig; számítsa ki a szükséges reagensmennyiséget, és a reakciórendszert az alábbi táblázat szerint készítse elő:
| Alkatrészek | N adag (25µl-es rendszer) |
| nCOV primer TaqMan próbakeverék | 18 µl × N |
| RT-PCR reakcióoldat | 2 µl × N |
| *N = vizsgált minták száma + 1 (negatív kontroll) + 1 (nCOVpozitív kontroll) | |
2.2 A komponensek alapos összekeverése után rövid ideig centrifugáljuk, hogy a cső falán lévő összes folyadék a cső aljára lecsepegjen, majd osszuk ki a 20 µl-es amplifikációs rendszert a PCR csőbe.
3 Mintavétel (minta-előkészítési terület)
Az extrakció után adjunk hozzá 5 μl negatív és pozitív kontrollt. A tesztelendő minta RNS-ét a PCR reakciócsőbe adjuk.
Szorosan zárja le a csövet, és centrifugálja 8000 fordulat/perc sebességgel néhány másodpercig, mielőtt áthelyezi az amplifikációs detektálási területre.
4 PCR amplifikáció (amplifikált detektálási terület)
4.1 Helyezze a reakciócsövet a műszer mintavételi cellájába, és állítsa be a paramétereket az alábbiak szerint:
| színpad | Ciklus szám | Hőmérséklet(°C) | Idő | gyűjteménytelek |
| Fordítottátírás | 1 | 42 | 10 perc | - |
| Elődenaturáción | 1 | 95 | 1 perc | - |
| Ciklus | 45 | 95 | 15 másodperc | - |
| 60 | 30-as évek | adatgyűjtés |
Műszer detektálási csatorna kiválasztása: Válassza ki a FAM, HEX, CY5 csatornát a fluoreszcencia jelhez. Referencia fluoreszcens jel esetén NONE (Nincs) csatorna esetén ne válassza a ROX csatornát.
5 Eredményelemzés (A beállításokat lásd az egyes műszerek kísérleti utasításaiban)
A reakció után mentse el az eredményeket. Az elemzés után a képnek megfelelően állítsa be az alapvonal kezdőértékét, végértékét és küszöbértékét (a felhasználó a tényleges helyzetnek megfelelően módosíthatja, a kezdőérték 3~15, a végérték 5~20 között állítható be, beállítás szükséges) a logaritmikus grafikonon. Az ablak küszöbértékénél a küszöbvonal a logaritmikus fázisban van, a negatív kontroll amplifikációs görbéje pedig egyenes vonalú vagy a küszöbvonal alatt van.
6. Minőségellenőrzés (A teszt eljárásellenőrzést is tartalmaz) Negatív ellenőrzés: Nincs egyértelmű amplifikációs görbe a FAM, HEX és CY5 detektálási csatornák esetében.
COV pozitív kontroll: a FAM és HEX detektáló csatornák amplifikációs görbéje jól látható, Ct érték ≤32, de a CY5 csatorna amplifikációs görbéje nem látható;
A fenti követelményeknek egyszerre kell teljesülniük ugyanazon kísérlet során, ellenkező esetben a kísérlet érvénytelen, és meg kell ismételni.
7 Az eredmények meghatározása.
7.1 Ha a tesztminta FAM és HEX csatornáiban nincs amplifikációs görbe, vagy a Ct-érték > 40, és a CY5 csatornában van amplifikációs görbe, akkor megállapítható, hogy nincs 2019-es új koronavírus (2019-nCoV) RNS a mintában;
.2 Ha a tesztminta egyértelmű amplifikációs görbéket mutat az FAM és HEX csatornákban, és a Ct-érték ≤40, akkor megítélhető, hogy a minta pozitív a 2019-es új koronavírusra (2019-nCoV).
7.3 Ha a tesztminta csak az egyik FAM vagy HEX csatornában mutat tiszta amplifikációs görbét, és a Ct érték ≤40, a másik csatornában pedig nincs amplifikációs görbe, az eredményeket újra kell tesztelni. Ha az ismételt teszt eredményei konzisztensek, a minta pozitívnak tekinthető az új csatornára nézve.
2019-es koronavírus (2019-nCoV). Ha az ismételt teszt eredménye negatív, akkor megítélhető, hogy a minta negatív a 2019-es új koronavírusra (2019-nCoV).
Pozitív ítéletérték
A ROC-görbe módszerrel határozzák meg a készlet referencia CT-értékét, a belső kontroll referenciaértéke pedig 40.
A teszteredmények értelmezése
1. Minden kísérletet negatív és pozitív kontrollokkal kell tesztelni. A teszteredményeket csak akkor lehet meghatározni, ha a kontrollok megfelelnek a minőségellenőrzési követelményeknek.
2. Amikor a FAM és a HEX detektáló csatornák pozitívak, a CY5 csatorna (belső kontrollcsatorna) eredménye negatív lehet a rendszerverseny miatt.
3. Ha a belső kontroll eredménye negatív, és a kémcső FAM és HEX detektáló csatornái is negatívak, az azt jelenti, hogy a rendszer le van tiltva, vagy a működése hibás, a teszt érvénytelen. Ezért a mintákat újra kell tesztelni.
