Termékek
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR érzékelőkészlet 2019-nCoV-hez
Várható használat
Ez a készlet az új koronavírus (2019-nCoV) minőségi kimutatására szolgál toroktampon, orrgarat tampon, bronchoalveoláris mosófolyadék és köpet segítségével. A termék kimutatási eredménye csak klinikai referencia, és nem használható egyedüliként. bizonyítékok a klinikai diagnózishoz és kezeléshez.Az állapot átfogó elemzése javasolt a beteg klinikai megnyilvánulásaival és egyéb laboratóriumi vizsgálatokkal kombinálva.
Ellenőrzési elv
A készlet egylépéses RT-PCR technológián alapul.Valójában a 2019-es új koronavírus (2019-nCoV) ORF1ab és N géneket választották ki az amplifikáció célrégiójaként.A specifikus primereket és fluoreszcens próbákat (az N génpróbákat FAM-mal, az ORF1ab próbákat pedig HEX-szel jelölik) a 2019-es új típusú koronavírus RNS kimutatására tervezték a mintákban.A készlet tartalmaz egy endogén belső kontroll-detektáló rendszert (CY5-tel jelölt belső kontrollgén-próba) a mintagyűjtés, az RNS és a PCR-amplifikáció folyamatának nyomon követésére, ezáltal csökkentve a hamis negatív eredményeket.
Fő összetevők
| Alkatrészek | Hangerő（48T/Kit） |
| RT-PCR reakcióoldat | 96 µl |
| nCOV primer TaqMan próbakeverék (ORF1ab, N gén, RnaseP gén) | 864 µl |
| Negatív kontroll | 1500 µl |
| nCOV pozitív kontroll (l ORF1ab N gén) | 1500 µl |
Saját reagensek: RNS extrakciós vagy tisztító reagensek.Negatív/pozitív kontroll: A pozitív kontroll a célfragmenst tartalmazó RNS, míg a negatív kontroll nukleinsavmentes víz.A használat során részt kell venniük az extrakcióban, és fertőzőnek kell őket tekinteni.Ezeket a vonatkozó előírásoknak megfelelően kell kezelni és ártalmatlanítani.
A belső referenciagén a humán RnaseP gén.
Tárolási feltételek és lejárati idő
-20±5 ℃, kerülje az 5-nél többszöri ismételt fagyasztást és felengedést, 6 hónapig érvényes.
Alkalmazható eszköz
FAM / HEX / CY5 és más többcsatornás fluoreszcens PCR műszerrel.
Mintakövetelmények
1. Alkalmazható mintatípusok: toroktamponok, nasopharyngeális tamponok, bronchoalveoláris mosófolyadék, köpet.
2. Mintavétel (aszeptikus technika)
Garattampon: Törölje le egyszerre két pálcikával a mandulákat és a hátsó garatfalat, majd merítse a tamponfejet a mintavételi oldatot tartalmazó kémcsőbe.
Köpet: Miután a betegnek mély köhögése van, gyűjtse össze a köhögött köpetet a mintavételi oldatot tartalmazó csavaros kupakos kémcsőben;bronchoalveoláris mosófolyadék: mintavétel egészségügyi szakemberek által.3.Minták tárolása és szállítása
A vírusizoláláshoz és az RNS-vizsgálathoz szükséges mintákat a lehető leghamarabb meg kell vizsgálni.A 24 órán belül kimutatható minták 4 ℃-on tárolhatók;amelyek 24-en belül nem észlelhetők
órákat -70 ℃ vagy annál alacsonyabb hőmérsékleten kell tárolni (ha nincs -70 ℃ tárolási körülmény, akkor
átmenetileg -20°C-os hűtőszekrényben tárolva).A minták szállítás közben kerüljék az ismételt fagyasztást és felengedést.A mintákat a gyűjtés után a lehető leghamarabb el kell küldeni a laboratóriumba.Ha a mintákat nagy távolságra kell szállítani, szárazjeges tárolás javasolt.
Vizsgálati módszerek
1 Mintafeldolgozás és RNS extrakció (mintafeldolgozási terület)
Az RNS extrakcióhoz 200μl folyékony minta vétele javasolt.A kapcsolódó extrakciós lépésekkel kapcsolatban lásd a kereskedelmi forgalomban lévő RNS extrakciós készletek utasításait.Negatív és negatív egyaránt
a kitben lévő kontrollok részt vettek az extrakcióban.
2 PCR reagens előkészítés (reagens előkészítési terület)
2.1 Vegyen ki minden alkatrészt a készletből, majd szobahőmérsékleten olvassa fel és keverje össze.Használat előtt néhány másodpercig centrifugálja 8000 fordulat/perc sebességgel;kiszámítja a szükséges reagensmennyiséget, és a reakciórendszert az alábbi táblázat szerint készítjük el:
| Alkatrészek | N adag (25 µl rendszer) |
| nCOV primer TaqMan próbakeverék | 18 µl × N |
| RT-PCR reakcióoldat | 2 µl × N |
| *N = a vizsgált minták száma + 1 (negatív kontroll) + 1 (nCOVpozitív kontroll) | |
2.2 A komponensek alapos összekeverése után centrifugálja rövid ideig, hogy a cső falán lévő összes folyadék a cső aljára hulljon, majd a 20 µl-es amplifikációs rendszert a PCR-csőbe öntse.
3 Mintavétel (minta-előkészítési terület)
Az extrakció után adjunk hozzá 5 μl negatív és pozitív kontrollt.A vizsgálandó minta RNS-ét hozzáadjuk a PCR reakciócsőhöz.
Zárja le szorosan a csövet, és centrifugálja 8000 ford./perc sebességgel néhány másodpercig, mielőtt átviszi az amplifikáció-érzékelő területre.
4 PCR-amplifikáció (amplifikált kimutatási terület)
4.1 Helyezze a reakciócsövet a műszer mintakamrájába, és állítsa be a paramétereket az alábbiak szerint:
| színpad | Ciklus szám | Hőfok(°C) | Idő | Gyűjteménywebhely |
| Fordítottátírása | 1 | 42 | 10 perc | - |
| Elődenaturáción | 1 | 95 | 1 perc | - |
| Ciklus | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30-as évek | adatgyűjtés |
Műszerészlelő csatorna kiválasztása: Válassza ki a FAM、HEX、CY5 csatornát a fluoreszcens jelhez.Referencia fluoreszkáló NONE esetén ne válassza a ROX-ot.
5 Eredményelemzés (A beállításhoz olvassa el az egyes műszerek kísérleti utasításait)
A reakció után mentse el az eredményeket.Az elemzés után állítsa be az alapvonal kezdőértékét, befejező értékét és küszöbértékét a képnek megfelelően (a felhasználó a tényleges helyzetnek megfelelően állíthatja be, a kezdőérték 3~15-re, a befejező érték a 5~20, beállítás) a logaritmikus grafikonon Az ablak küszöbén a küszöbvonal a logaritmikus fázisban van, a negatív kontroll erősítési görbéje pedig egyenes vagy a küszöbvonal alatti).
6 Quauty control (A teszt tartalmaz egy eljárási vezérlést) Negatív kontroll: Nincs nyilvánvaló erősítési görbe a FAM, HEX, CY5 észlelési csatornákhoz
COV pozitív kontroll: a FAM és HEX detektálási csatornák nyilvánvaló amplifikációs görbéje, Ct érték ≤32, de a CY5 csatorna amplifikációs görbéje nincs;
A fenti követelményeket egyidejűleg kell teljesíteni ugyanabban a kísérletben;ellenkező esetben a kísérlet érvénytelen, és meg kell ismételni.
7 Az eredmények meghatározása.
7.1 Ha a vizsgált minta FAM és HEX csatornáiban nincs amplifikációs görbe vagy Ct-érték > 40, és van amplifikációs görbe a CY5 csatornában, akkor megállapítható, hogy nincs 2019-es új koronavírus (2019-nCoV). RNS a mintában;
.2 Ha a tesztmintában nyilvánvaló amplifikációs görbék vannak a FAM és HEX csatornákban, és a Ct-érték ≤40, akkor megállapítható, hogy a minta pozitív a 2019-es új koronavírusra (2019-nCoV).
7.3 Ha a tesztminta csak az egyik FAM vagy HEX csatornában rendelkezik tiszta erősítési görbével, és a Ct érték ≤40, a másik csatornában pedig nincs amplifikációs görbe, az eredményeket újra meg kell vizsgálni.Ha az ismételt vizsgálat eredményei konzisztensek, a minta pozitívnak tekinthető az újra nézve
koronavírus 2019 (2019-nCoV).Ha az újbóli vizsgálat eredménye negatív, akkor megállapítható, hogy a minta negatív a 2019-es új koronavírusra (2019-nCoV).
Pozitív ítéletérték
A készlet referencia CT-értékének meghatározására a ROC görbe módszerét használják, a belső kontroll referenciaértéke pedig 40.
A vizsgálati eredmények értelmezése
1. Minden kísérletet meg kell vizsgálni negatív és pozitív kontrollok szempontjából.A vizsgálati eredmények csak akkor határozhatók meg, ha az ellenőrzések megfelelnek a minőség-ellenőrzési követelményeknek
2. Ha a FAM és HEX érzékelési csatornák pozitívak, a CY5 csatorna (belső vezérlőcsatorna) eredménye negatív lehet a rendszerverseny miatt.
3. Ha a belső kontroll eredménye negatív, ha a kémcső FAM és HEX érzékelési csatornái is negatívak, az azt jelenti, hogy a rendszer le van tiltva vagy a működés hibás, t a teszt érvénytelen.Ezért a mintákat újra meg kell vizsgálni.
